Como contar o número de células
experimentos microbianas muitas vezes exigem que sabemos quantas bactérias, por exemplo, estão presentes. Conhecendo o número de células microbianas ajuda a indicar se as células estão a crescer ou morrer e que ajuda experiências para ser consistente de dia para dia.
Os métodos para decifrar o número de células presentes facilidade e precisão são utilizados em laboratórios de microbiologia todos os dias. Estes incluem métodos directos, onde as colónias são contadas directamente e os métodos indirectos em que uma estimativa do número de células é feita.
Os métodos diretos de células contagem
Determinação do número de células bacterianas que estão vivos numa amostra é feito usando contagens viáveis. Cada método para calcular os números de organismos viáveis de tira vantagem do facto de quando uma suspensão de bactérias foi semeada em suportes sólidos, cada um viver célula bacteriana vai crescer para formar uma colónia, que é suficientemente grande para ser visto.
Quando a concentração de bactérias numa amostra é elevada, ele deve ser suficientemente diluído de modo a que as colónias são distintos um do outro, o que é feito com diluição em série.
Na figura, uma cultura de bactérias é diluída várias vezes por adição de um volume fixo ao primeiro tubo (a primeira diluição) e, em seguida, tendo um volume fixo a partir do primeiro tubo e adicionando-o ao segundo tubo (a segunda diluição). Isto é repetido várias vezes (que é por isso que ele é chamado serial diluição), num esforço para diluir a cultura bacteriano original.
Um pequeno volume de cada diluição é então plaqueada em células bacterianas individuais de agar e cada forma será uma colónia. diluições crescentes irá resultar numa diminuição do número de bactérias presentes e, portanto, uma diminuição do número de colónias em cada placa de agar. O número de colónias é então utilizada para calcular para trás, para determinar o número exacto de células que estavam presentes na amostra original.
Para calcular o número de células viáveis na amostra original, o número de colónias presentes depois de as placas foram incubadas é multiplicada pelo factor de diluição. O número de células numa amostra é normalmente expressa em unidades formadoras de colónias (CFU) por unidade de volume (neste caso mL) ou de UFC / mL.
Quando o número de células numa amostra é muito baixo, tal como na água do lago, um grande volume de amostra pode ser passada através de um filtro, que é, em seguida, cultivadas com a forma adequada para produzir colónias do microrganismo de interesse. Neste caso, o número de colónias é dividida pelo volume da amostra filtrada.
Por exemplo, se 5 litros (L) de água do lago foi filtrada e 100 colónias apareceram após a incubação, em seguida, o número original de bactérias na água foi de 100 colónias / 5 L = 20 UFC / L.
Outra forma de contagem do número de células numa amostra ocorre por contagens microscópicas diretas. Com este método, todas as células da amostra - vivo ou morto - são contados, mas dá-lhe uma estimativa imediata do número de bactérias sem a necessidade de incubar uma amostra por 24 horas ou mais.
Métodos indiretos de células contagem
Embora não seja tão preciso, métodos indiretos são mais rápidos e mais conveniente do que os métodos diretos em estimar o número de micróbios em uma amostra.
turvação representa a quantidade de dispersão da luz provocada pelas células em uma cultura líquida. Um aparelho chamado espectrofotômetro passa um feixe de luz através de um tubo transparente contendo uma cultura bacteriana. À medida que o número de células numa cultura aumenta, mais luz é dispersa e menos do que passa através do tubo a ser registada no outro lado.
A turbidez é expressa como absorvância e densidade como óptica (OD). Quanto maior o número (entre 0 e 2), o mais concentradas as células na solução.
Outra maneira de estimar indirectamente o número de células é a de medir a actividade metabólica da amostra para um substrato específico. Desta forma, a quantidade de resíduos produzidos - quer um gás que pode ser capturado e medido ou um metabolito que pode ser utilizada com um indicador nos meios - pode ser usada para calcular o número de células em crescimento são na cultura.
O último método para estimar indirectamente o número de células é através do cálculo do peso seco do organismo em cultura. Este método é frequentemente usado com fungos que formam colônias filamentosas longos que não são facilmente quebrados por diluição. A amostra é concentrada e o líquido é removido. Em seguida, as células são secos e pesados.